Преждевременная яичниковая недостаточность

Преждевременная яичниковая недостаточность

Фолликулогенез

Аутоантитела к 3-бетагидроксистероид дегидрогеназе редко встречаются при преждевременной яичниковой недостаточности

Аутоантитела к 3-бета-гидроксистероиддегидрогеназе у пациенток с идиопатической преждевременной яичниковой недостаточностью. N– и C– концевые эпитопы

Генотип HLA DQB1, кодирующий аспартат в позиции 57, связан с аутоиммунитетом к 3-бета-гидроксистероиддегидрогеназе при преждевременной яичниковой недостаточности

Преждевременная яичниковая недостаточность

G.S.Conway

Br. Med Bull, 2000; 56, No3, pp 643-649.

Обычно менопауза наступает в возрасте около 50 лет; у 1% женщин менструации продолжаются до 60 лет, у 1% – прекращаются до 40. Официально преждевременной считается менпоауза, наступившая до 40 лет.

Преждевременная яичниковая недостаточность может вызываться различными факторами, снижающими число ооцитов в яичнике. У эмбриона первые предшественники гамет появляются в урогенитальном синусе. Затем эти клетки мигрируют в яичник. Там они размножаются, образуя по 3,4 млн потенциальных ооцитов в каждом яичнике (см. Фолликулогенез). С этого времени ооциты находятся в заторможенном процессе мейоза до их выхода в овуляцию – для каких-то только через 40 лет. Если у женщины овуляция происходит в каждом месяце в течение всей ее репродуктивной жизни, она может использовать менее 500 яйцеклеток – мельчайшая доля от исходных 7 млн (0,007%). Если же женщина предотвращает овуляцию, например, постоянно используя комбинированные оральные контрацептивы, возраст менопаузы все равно не отодвигается. Время наступления естественной менопаузы генетически запрограммировано, дочери получают это свойство от своих матерей, а также это зависит от факторов окружающей среды, таких как курение.

Большинство половых клеток гибнут благодаря апоптозу. (См. Апоптоз в регуляции функции яичников) Перед рождением 2/3 из 7 млн уже погибли благодаря механизмам естественного отбора. Между детством и 40 годами количество яйцеклеток постепенно уменьшается приблизительно с 1 млн до 10 тыс в каждом яичнике. Около 40 лет процесс гибели яйцеклеток усиливается, и к 50 годам остаются единичные клетки. При аномалиях Х-хромосомы, например, при синдроме Тернера, когда одна Х-хромосома отсутствует, продукция половых клеток не нарушена, но первая фаза их гибели резко усилена, таким образом к рождению остается несколько штук.

Этиология преждевременной яичниковой недостаточности

У большинства женщин причины наступления этого состояния неизвестны. Психологическую травму, возникающую при столкновении с подобным диагнозом, можно уменьшить четким определением механизма его развития. Известные причины пржедевременной яичниковой недостаточности можно подразделить на факторы генетические и внешней среды (Табл. 1).

Идиопатические (включая аутоиммунные) – 204 (58%)

Синдром Тернера – 82 (23%)

Химиотерапия – 24 (7%)

Семейный анамнез – 15 (4%)

Операция на органах малого таза – 8 (2%)

Дисгенезия гонад 46, XY – 7 (2%)

Галактоземия – 6 (2%)

Облучение малого таза – 6 (2%)

Любой дефект женской половой Х-хромосомы может вызвать преждевременную яичниковую недостаточность. Самой частой формой является синдром Тернера. У женщин с синдромом Тернера имеется единственная Х-хромосома, кариотип – 45, Х0. Фенотип синдрома Тернера: низкий рост, отсутствие спонтанного пубертата. Ранняя закладка яичников при синдроме Тернера в норме, но все половые клетки гибнут до рождения, создавая картину дисгенезии гонад. Синдром Тернера демонстрирует необходимость наличия двух интактных Х-хромосом для нормальной функции яичников. В исследованиях женщин с частичными делециями Х-хромосомы выяснилось, что как минимум три локуса ответственны за развитие яичников. На коротком плече Х-хромосомы находятся гены, отвечающие за развитие стигм синдрома Тернера и первичной аменореи. Особый интерес представляет локус Хр22, где находятся гены, отвечающие за инактивацию Х-хромосомы у людей. Минимальная делеция Х-хромосомы, способная вызвать преждевременную яичниковую недостаточность, идентифицирована в локусах Хq26-Xq28 – ген преждевременной яичниковой недостаточности. Третьим локусом, отвечающим за развитие яичников, является Xq13-22.

Наблюдаются семейные случаи преждевременной яичниковой недостаточности при отсутствии каких-либо цитогенетических дефектов. Вероятно будут найдены генетические маркеры, которые позволят предсказать развитие преждевременной яичниковой недостаточности у будущих поколений в таких семьях. С этих позиций при выяснении возможной причины преждевременной яичниковой недостаточности у пациентки очень важно тщательное изучение семейного анамнеза. Из известных типов наследования семейной преждевременной яичниковой недостаточности отмечены аутосомно-доминантный, аутосомно-рецессивный и сцепленный с Х-хромосомой типы наследования.

Преждевременная яичниковая недостаточность также встречается в семьях с редкими наследственными патологиями – такими как галактоземия, блефарофимоз. В этих случаях механизм повреждения овогенеза неясен. При галактоземии развивается именно првичная аменорея у женщин, в то время как половая сфера мужчин остается интактной. При блефарофимозе только в половине семей присутствует яичниковая недостаточность, причем с клинической картиной резистентных яичников. В Финляндии описана мутация Ala189Val, поражающая внеклеточный домен рецептора к ФСГ, у 22 женщин с преждевременной менопаузой из 6 семейств с первичной аменореей.

Любое оперативное вмешательство на органах малого таза – удаление кист яичников, гистерэктомия – может повредить яичники, вероятно влияя на их кровоснабжение или вызывая воспалительный процесс в окружающих тканях. Риск развития яичниковой недостаточности для большинства рутинных операций невысок. Операции на более отдаленных органах, например, на аппендиксе, не повреждают яичники – несмотря на то, что сочетающаяся инфекция может вызвать бесплодие путем формирования спаек между фаллопиевыми трубами и окружающими органами. Поскольку все большее количество женщин выживает после перенесенных в детстве злокачественных опухолей и лейкозов, мы считаем, что химио– и лучевая терапия могут быть причиной преждевременной яичниковой недостаточности. Этой группе женщин предлагают криоконсервацию яичниковой ткани перед химиотерапией.

Примерами эндокринных и аутоиммунных расстройств, сочетающихся с яичниковой недостаточностью, являются гипотиреоз, надпочечниковая недостаточность (болезнь Аддисона), сахарный диабет 1 типа. Аутоиммунное повреждение яичников может быть и изолированным, при интактных остальных железах.

Представляет интерес поиск аутоиммунных маркеров, позволяющих прогнозировать развитие яичниковой недостаточности. При своевременном начале иммуносупрессивной терапии развитие полной яичниковой недостаточности можно предотвратить. Немногочисленные пилотные исследования позволяют предположить, что лечение преднизолоном может обратить развитие яичниковой недостаточности у некоторых женщин.

У большинства женщин с преждевременной яичниковой недостаточностью нет ни семейной истории, ни хромосомных аномалий, ни признаков аутоиммунных нарушений. Мы можем предположить, что имеют место факторы внешней среды, возможно подействовавшие в прошлом. Известно, что у мужчин некоторые вирусы, в частности вирус эпидемического паротита, могут вызвать воспаления гонад, становясь причиной бесплодия. Популярна точка зрения об общепопуляционом ухудшении параметров спермограммы из-за усиленного в последнее время воздействия на тестикулы вредных факторов внешней среды, токсинов и медикаментов. Вероятно, что и яичники подвержены неблагоприятному воздействию токсинов или вирусов.

Диагностика яичниковой недостаточности

Диагноз яичниковой недостаточности ставится путем измерения ЛГ и ФСГ, уровень которых в крови возрастает, и эстрогенов, чей уровень, наоборот, снижается. Самым чувствительным из этих показателей является подъем ФСГ, который является лучшим ранним маркером яичниковой недостаточности. Наступление беременности крайне маловероятно при ФСГ в 2 раза выше нормы (20 Ед/л по срю с 10 Ед/л). Реально ФСГ возрастает во вторую половину репродуктивной жизни параллельно со снижением фертильности – после 30 лет.

Первым субъективным симптомом яичниковой недостаточности является аменорея. Имеется множество причинпрекращения менструаций: беременность, потеря веса, многие гормональные нарушения, но яичниковая недостаточность – единственная причина аменореи, сопровождающейся подъемом уровней ЛГ, ФСГ и снижением эстрадиола. Кроме аменореи снижение уровня эстрогенов в крови ведет к таким симптомам, как приливы жара, изменения настроения, сухость во влагалище – эти симптомы не специфичны именно для преждевременной менопаузы.

В большинстве случаев гормональный статус, характерный для менопаузы, означает четкий и необратимый диагноз. Иногда, однако, фаза сниженной активности яичников временна, и они возвращаются к исходной функциональной активности. По этой причине необходимо повторное измерение гормонов через несколько недель для установления диагноза преждевременная менопауза. Далее полезно мониторировать уровень ФСГ с интервалами 1 мес лдя определения степени активности яичников. Любые попытки достижения беременности должны производиться в те временные интервалы, когда уровень ФСГ падает до нормальных значений. Со временем вероятность возвращения яичников к нормальному уровню функциональной активности уменьшается, хотя казуистически редко спонтанные беременности наступают и на фоне длительно существующей преждевременной яичниковой недостаточности. Механизмы этой реверсии неизвестны, и неизвестно, как увеличить их вероятность при помощи препаратов. Полезность биопсии яичников обсуждается. Некоторые клиники предпочитают биопсию ультразвуковому исследованию. Ультразвук способен определить яичники у 2/3 женщин с преждевременной яичниковой недостаточностью, а во время биопсии только у 10-15% женщин можно обнаружить ткань яичников. Внешнему виду яичников сегодня не придается большого значения – наилучшим образом выглядящие яичники не позволят созреть яйцеклетке, если не отвечают на стимуляцию ФСГ и если его уровень постоянно высок.

Прогноз при преждевременной яичниковой недостаточности

Процесс наступления менопаузы – естественной или преждевременной – колеблется во времени. У некоторых женщин регулярный менструальный цикл вдруг резко прекращается, у других переход от нормальной менструальной функции к полной менопаузе длится годами с колебаниями активности яичников. Редко происходит частичное угнетение функции яичников – частичное, но постоянное, без прогрессии до полной менопаузы – это состояние сопровождается подъемом уровня ФСГ и бесплодием и характеризуется как синдром резистентных яичников. После того, как менструации отсутствуют в течение 6 мес и установлен диагноз преждевременной яичниковой недостаточности, менее 1% женщин могут достигнуть беременности – по нашему опыту. Спонтанная беременность никогда не невозможна, но крайне маловероятна. Некоторые критерии увеличивают шансы наступления спонтанной беременности: колебания уровня ФСГ, обнаружение яичников на УЗИ, связь с аутоиммунными нарушениями или химиотерапией. Для молодых женщин с яичниковой недостаточностью актуальна не только проблема бесплодия, но и годы жизни с ЗГТ. Женщины с длительно существующим эстрогенным дефицитом имеют повышенный риск остеопороза и сердечно-сосудистых заболеваний, но меньший риск рака молочной железы и, возможно, тромбозов. Сравнительный анализ все-таки склоняется в большую пользу и меньший риск длительной ЗГТ. Однако в каждом случае вопрос решается индивидуально.

Аутоантитела к 3-бетагидроксистероид дегидрогеназе редко встречаются при преждевременной яичниковой недостаточности

K.Reimand, P.Peterson, H.Hyoty et al

The J. of Clin. Endocrin and Metabolism, 2000, Vol. 85, No 6, рр 2324-2326

Преждевременная яичниковая недостаточность – это синдром, при котором менопауза наступает в возрасте до 40 лет. Это расстройство гетерогенной этиологии, в патогенезе которого могут играть роль такие факторы, как генетические или инфекционные. В качестве одной из возможных причин преждевременной яичниковой недостаточности предполагается аутоиммунный процесс, но его доля в структуре преждевременной яичниковой недостаточности до сих пор не определена. Гипотеза аутоиммунной причины преждевременной яичниковой недостаточности подтверждается его частой встречаемостью при других аутоиммунных эндокринных нарушениях, а также наличием у пациенток аутоантител к стероид-продуцирующим клеткам (СПК-АТ), особенно при сочетании с болезнью Аддисона, и лимфоцитарной инфильтрацией яичников, обнаруживаемой на гистологии. При реакции непрямой иммунофлюоресценции СПК-АТ реагируют с клетками, синтезирующими стероиды: коры надпочечников, теки интерны и желтого тела яичников, клетки Лейдига тестикул и плацентарные трофобласты. СПК-АТ обнаружены у 52% пациенток с преждевременной яичниковой недостаточностью, в то же время другие исследователи обнаруживают их только у 1% пациенток.

В качестве молекулярных мишеней СПК-АТ описаны два фермента стероидогенеза: 17-альфа-гидроксилаза (Р450с17) и фермент, отщепляющий боковые цепи (Р450scc). Аутоантитела к З450с17 и Р450scc, а также к 21-гидроксилазе (Р450с21) – ферменту, экспрессирующемуся только в коре надпочечников, обнаружены в сыворотке пациенток с болезнью Аддисона при двух аутоиммунных полигландулярных синдромах (АПС). У пациентов с 1 типом АПС-1 имеются аутоантитела ко всем трем ферментам, а у пациентов с АПС2 и изолированной болезнью Аддисона преобладают аутоантитела к Р450с21. Обнаружение СПК-АТ при преждевременной яичниковой недостаточности, ассоциированной с болезнью Аддисона, и тесная связь этих болезней поддерживают гипотезу об общем патогенезе аутоиммунитета против надпочечников и яичников. Однако молекулярная природа аутоантигенов при преждевременной яичниковой недостаточности, не связанной с болезнью Аддисона (идиопатическая преждевременная яичниковая недостаточность), остается неизвестной.

Фермент 3-бета-гидроксистероид дегидрогеназа (3-бета ГСД) недавно охарактеризован как аутоантиген при преждевременной яичниковой недостаточности. Этот фермент вовлечен в стероидный обмен и экспрессируется на всех тканях, распознающих СПК-АТ. Для дальнейшего изучения этой реактивности мы определяли у пациентов с преждевременной яичниковой недостаточностью, АПС1, АПС2, изолированной болезнью Аддисона, сахарным диабетом 1 типа (СД1) и здоровых людей из контрольной группы СПК-АТ методом ИФА и 3-бета-ГСД методом иммунопреципитации с транслированным in vitro антигеном. Мы также изучали реактивность сыворотки при преждевременной яичниковой недостаточности к двум другим специфическим аутоантигенам стероидных клеток: Р450с17 и Р450scc.

Образцы сыворотки

Образцы сыворотки от 48 пациенток из северной Англии (ср. возраст 36 +– 11 лет, разброс от 17 до 67 лет) с преждевременной яичниковой недостаточностью собирали в период 1992-1996 гг. Преждевременную яичниковую недостаточность определяли на основании гипергонадотропной аменореи с сывороточными уровнями ЛГ и ФСГ более 10 МЕ/л, определенными как минимум дважды. У 30 пациенток не было обнаружено видимой причины преждевременной яичниковой недостаточности или других сочетающихся заболеваний, у 7 – ятрогенная или генетическая (синдром Тернера) этиология, у 11 – сочетающиеся аутоиммунные расстройства (болезнь Аддисона у 6, аутоиммунные поражения щитовидной железы у 5). Кроме того использовали сыворотку 15 финских пациентов с АПС-1, 9 финских пациентов с изолированной болезнью Аддисона, 28 финских пациентов с впервые диагностированным СД1. В качестве контроля использовали сыворотки 48 здоровых добровольцев из северной Англии и 23 – из Финляндии. От всех пациентов получено информированное согласие. Сыворотку хранили замороженной при –20С.

В качестве антигенного субстрата использовали человеческие надпочечники, плаценту, яичники, а также тестикулы макаки. Готовили срезы для криостата толщиной 6 мкм и инкубировали с тестируемой сывороткой в разведениях от 1:5 до 1:100, а затем обрабатывали иммунофлюоресцентными антителами (флюоресцирующий изотиоцианат-конъюгированный кроличий античеловеческий IgG).

С-терминальный участок человеческой кДНК 3-бета-ГСД из 287 аминокислот связывали с N-концевой частью, амплифицировали методом ПЦР с 3-бета-ГСД специфическими праймерами, обрабатывали рестриктазами EcoRI, KnpI, формируя полную кДНК 3-бета-ГСД на векторе pGEM3. Оба образца – полную кДНК (pGEM3бетаГСД) и С-концевой фрагмент (pGEM3бетаГСДС) обрабатывали праймером Т7 для формирования правильной ориентации и рамки считывания кДНК. Гены pGEM3бетаГСД и pGEM3бетаГСДС, так же как pJEX17 и pJEXscc (клонированные Р450с17 и Р450scc) транскрибировали с помощью Т7 РНК-полимеразы и транслировали в 35S-цистеин-меченный протеин. Затем продукт трансляции очищали на хроматографической колонне Сефадакс G-50 и анализировали с помощью ауторадиографии и SDS-PAGE.

В каждом исследовании образец с транслированным протеином разводили в 50 мкл RIP-буфера (20 ммоль/л Tris, рН=8,0$ 150 ммоль/л хлорида натрия, 0,1% Triton X-100; 10 мкг/мл апротинина) и инкубировали с разведенной сывороткой (1:10 в RIP буфере) в течение 1 ч при комнатной температуре. 50 мкл Sepharose Fast Flow протеина, разведенного 1:5 в RIP-буфере добавляли и инкубировали в течение 1 ч при комнатной термпературе, встряхивая. Иммунные комплексы отмывали 4 раза с помощью центрифугирования, анализ проводили с помощью SDS-PAGE, а затем с помощью ауторадиографии.

2 из 48 (4%) пациенток с преждевременной яичниковой недостаточностью имели СПК-АТ в своей сыворотке, еще у 2 были антитела к коре надпочечников (КН-АТ). У обеих СПК-АТ–позитивных паценток была болезнь Аддисона, так же как у 1 пациентки с КН-АТ. У второй пациентки с преждевременной яичниковой недостаточностью и КН-АТ дополнительно было аутоиммунный гипотиреоз. СПК-АТ были обнаружены у 11 из 15 пациенов с АПС1 и у 1 из 9 с АПС2. У пациентов с изолированной болезнью Аддисона, СД1 и из контрольной группы не было СПК-АТ. 35S-цистеин-меченные продукты генов pGEM3бетаГСД и pGEM3бетаГСДС имели, как и ожидалось, связаные участки весом весом 42 и 31 кДа, соответственно, при SDS-PAGE и ауторадиографии (рис. 1). В качестве положительного контроля кроличья антисыворотка против человеческой 3-бета ГСД четко распознала оба 35S-цистеин-меченные продукта генов pGEM3бетаГСД и pGEM3бетаГСДС в реакции иммунопреципитации. Во время иммунопреципитации с человеческой сывороткой у 1 СПК-АТ позитивной пациентки с преждевременной яичниковой недостаточностью происходила преципитация с 3бетаГСД-продуктом (1 из 41 идиопатической преждевременной яичниковой недостаточностью, 2,4%). Другая СПК-АТ-позитивная сыворотка, так же как остальные сыворотки 46 пациенток с преждевременной яичниковой недостаточностью оставались негативны. Кроме того, в 3 сыворотках из 15 от пациентов с АПС1, которые все были позитивны по СПК-АТ, реагировали с этим продуктом (20%). Ни одна сыворотка из 9 с АПС-2, 38 с изолированным синдромом Аддисона, 28 с СД 1 типа, 71 контрольных не была способна преципитировать с продуктом 3-бета-ГСД. При использовании для преципитации pGEM3бетаГСДС – продукта ни одного положительного связывания не было обнаружено при ауторадиографии, что показывает что эпитопы, необходимые для связывания аутоантител, локализованы в 86-аминокислотном N-концевом остатке протеина. Поскольку 10 АПС– и 1 АПС2 сывороток были позитивны по анти-Р450scc аутоантителам, сыворотки пациенток с преждевременной яичниковой недостаточностью были проанализированы на присутствие этих антител. Однако никакой антительной реактивности этих образцов сыворотки с Р450с17 и Р450scc аутоантителами не наблюдалось.

Аутоиммунная природа преждевременной яичниковой недостаточности предполагается в некоторых случаях, демонстрация ключевого аутоантигена является важным шагом в доказательстве этой гипотезы. Очевидно, что преждевременная яичниковая недостаточность может вызываться многими факторами, такими как генетические аномалии и инфекции, и различение истинной первичной аутоиммунной этиологии от вторичной, вызванной инфецкионными, ятрогенными генетическими факторами, очень затруднено. Недавно было открыто новое доказательство аутоиммунного механизма преждевременной яичниковой недостаточности – ее связь с DQ-аллелями лейкоцитарных антигенов с аспартатом в позиции 57. Недавний отчет об обнаружении аутоантител к стероидогенному ферменту 3-бета-ГСД, не принадлежащему семейству Р450, в относительно большом проценте случаев преждевременной яичниковой недостаточности (21%) было интригующим и предположило идиопатический компонент аутоиммунной яичниковой недостаточности, отличающийся от АПС1 и болезни Аддисона. Наши результаты показали однако, что присутствие аутоантитела к 3-бета-ГСД достаточно редко (2%) у пациенток с преждевременной яичниковой недостаточностью. Напротив, мы обнаружили аутоантитела к 3-бетаГСД в даже более высоких концентрациях (20%) среди изучаемых пациентов с АПС-1. Интересно, что все 4 образца сыворотки, позитивной по анти 3-бета-ГСД антителам преципитировали с протеином полной длины, но не с С-концевым его полипептидом, что доказывает местонахождение иммунодоминантного эпитопа в N-концевой части 3-бета-ГСД. Общий эпитоп при 1 преждевременной яичниковой недостаточности и 3 АПС1, в свою очередь, отражает частичное присутствие обычных аутоиммунных мехнизмов в патогенезе преждевременной яичниковой недостаточности и АПС-1. Хотя имеющая дополнительно болезнь Аддисона 3-бета-ГСД-АТ– позитивная пациентка с преждевременной яичниковой недостаточностью не может принадлежать к группам АПС-1 и АПС-2, поскольку не имела признаков кандидоза и гипопаратиреоза, а также СД1 или аутоиммунного гипотиреоза. Более того, не было обнаружено мутаций в ее ДНК в двух наиболее частых позициях (R257X, 1094-1106del) в аутоиммуно-регуляторном гене, вызывающем АПС-1.

В предыдущих исследованиях ни один из случаев преждевременной яичниковой недостаточности, позитивных по анти-3бетаГСД-АТ, не был ассоциирован с болезнью Аддисона, и только у 3 из 48 было аутоиммунное заболевание щитовидной железы, по сравнению с 6 и 5, соответственно, в нашем эксперименте. Пока непонятно как объяснить такую разницу в обнаруженной частоте 3-бета-ГСД-АТ, поскольку у 2 из 3 пациенток с преждевременной яичниковой недостаточностью и гипотиреозом из первого исследования были 3-бета-ГСД-АТ, и большая часть пациентов в нашем исследовании с сопутствующими аутоиммунными расстройствами имела большую вероятность определения 3-бета-ГСД-АТ. Мы, кроме того, включили в исследование 7 пациенток с преждевременной яичниковой недостаточностью ятрогенной или генетической этиологии, покольку мы и другие авторы ранее обнаружили яичниковые антитела с помощью иммуносорбентного анализа у таких пациентов, повышающиеся после повреждения яичников, и нас интересовало, направлены ли эти яичниковые антитела напрямую против 3-бетаГСД. Мы не смогли обнаружить 3-бетаГСД-АТ у наших пациентов с СД1, хотя большой процент таких пациентов (23%) отмечался в предыдущем исследовании.

Поскольку ферменты Р450с7 и Р450scc известны как мишени СПК-АТ, мы изучали реактивность сыворотки пациенток с преждевременной яичниковой недостаточностью с этими двумя ферментами. Ранее мы показали, что СПК-АТ в основном, если не всегда, наблюдаются при АПС-1, что приводит к их реактивности против этих двух ферментов. Все трое пациентов с АПС1 с 3-бетаГСД-АТ имели также антитела к Р45-с17 и Р450scc, но ни одна сыворотка больных преждевременной яичниковой неодстаточностью не преципитировала с этими ферментами. Отсутствие аутоантител к этим ферментами при преждевременной яичниковой недостаточности и АПС2 и наличие общего иммунного ответа в яичниковом и надпочечниковом аутоиммунитете предполагает наличие других аутоантигенов в стероидных клетках. Среди наших пациенток с преждевременной яичниковой недостаточностью, сыворотки, СПК-АТ-позитивные, но 3-бетаГСД-негативные не обладали реактивностью против Р450с17 и Р450scc, что предполагает наличие еще нетипированных СПК.

Наши находки показали, что аутоантитела к 3-бета-ГСД редко встречаются у пациенток с преждевременной яичниковой недостаточностью, т.о. их значимость как диагностического маркера очень низка. Однако из-за расхождения с результатами предыдущих исследований, частота встречаемости и истинная клиническая значимость 3-бета-ГСД-АТ остается невыясненной и требует дальнейших исследований в этом направлении.

Аутоантитела к 3-бета-гидроксистероиддегидрогеназе у пациенток с идиопатической преждевременной яичниковой недостаточностью. N– и C– концевые эпитопы

S.Arif, R.Varela-Calvino, G.S.Conway, M.Peakman

J Clin Endocrinol and Metabolism, 2001, 86 (12):5892-5897

Преждевременная яичниковая недостаточность – синдром, клинически определяемый как потеря яичниковой функции до 40 лет. Это гетерогенное расстройство с многофакторным патогенезом: хромосомные аномалии, генетические расстройства, нарушения обмена веществ, ятрогенные нарушения, инфекции. Однако у многих женщин этиология преждевременной яичниковой недостаточностью до сих пор не известна, и для этих идиопатических случаев предположены аутоиммунные причины. Это предположение поддерживается гистологическими находками, демонстрирующими лимфоцитарную инфильтрацию яичников; присутствием аутоантител к антигенам яичников и сочетанием с другими аутоиммунными расстройствами. Антитела к стероидпродуцирующим клеткам (СПК-АТ), направленные напрямую против стероидных клеток коры надпочечников, теки интерны яичников, клеток Лейдига тестикул, плацентарного трофобласта – описаны при преждевременной яичниковой недостаточности с частотой встречаемости от 1 до 52%. Ранее мы идентифицировали фермент стероидных клеток 3бета-гидроксистероид-дегидрогеназу (3бетаГСД) как аутоантиген при идиопатической преждевременной яичниковой недостаточности. Более того, у пациенток спреждевременной яичниковой недостаточностью и аутоантителами к 3-бетаГСД имелся особый генотип HLA II класса – аспартатный остаток в 57 позиции бета-цепи DQ (HLA-DQбета– Asp57). Эта демонстрация связи генотипа HLA II класса с аутоантителами к 3-бетаГСД поддерживает гипотезу аутоиммунного происхождения некоторых форм идиопатической преждевременной яичниковой недостаточности, поскольку такая ассоциация типична для других аутоиммунных расстройств.

В нашем оригинальном исследовании уровень аутоантител к 3-бетаГСД определяли с помощью метода иммуноблот. Формат исследования определял некоторые ограничения. Во-первых, антиген денатурирован, таким образом только линейные эпитопы доступны для связывания аутоантител. Аналитическая чувствительность и специфичность могут быть снижены при потере конформационных эпитопов. Во-вторых, анализ является скорее качественным, чем количественным.

Целью настоящего исследования было измерение уровня аутоантител методом иммунопреципитации меченного радиоактивным атомом нативного рекомбинантного 3бетаГСД, созданного в транскрипционно/трансляционной системе in vitro. Мы также постарались определить участки 3-бетаГСД, содержащие основные связывающие аутоантитела сайты.

В исследование было включено 100 пациенток с идиопатической преждевременной яичниковой недостаточностью, обратившихся в Репродуктивную Эндокринологическую клинику в госпитале Миддлсекса (Лондон, Англия). Средний возраст 26 лет, разброс 11-39. Преждевременную яичниковую недостаточность определяли как гипергонадотропную аменорею с сывороточными уровнями ЛГ и ФСГ более 20 МЕ/л двукратно. В нашей лаборатории верхнее референсное значение уровней ЛГ и ФСГ для женщин 11-29 лет составляет 10 МЕ/л, для женщин старше 30 лет – 15 МЕ/л. СПКЯ был исключен на основании клинических и ультразвуковых данных. Пациенты с преждевременной яичниковой недостаточностью, развившейся вторично на фоне синдрома Тернера, химиотерапии, тазовой хирургии, облучения малого таза, галактоземии, генотипа 46,XY были исключены из исследования.

У 10 пациенток была первичная аменорея, у 90 – вторичная. Болезнь Аддисона исключали при клиническом обследовании, измерении электролитов сыворотки и с помощью пробы с синактеном. У 4 пациенток были аутоиммунные заболевания щитовидной железы, из них у 3 – гипотиреоз, получали лечение тироксином; у 1 – болезнь Грейвса. В качестве контрольной группы сыворотку брали у 103 здоровых доноров женского пола (средний возраст 27 лет, разброс 18-43г).

кДНК для человеческого 3-бетаГСД амплифицировали с помощью Pfu полимеразы в ПЦР со следующими праймерами верхней и нижней полоски: 5’GCTCTAGAGCCGCCACCATGGGCTGGAGCTGCCTTGTG 3’ и 5’GCTCTAGAGCTCACTGA GTCTTGGACTTCAGG 3‘, соответственно. Амплифицированный продукт обрабатывали XbaI и клонировали с pSP64 PolyA вектором. Для уточнения полученной последовательности проводили автоматический сиквенс с известными праймерами.

кДНК человеческого 3-бетаГСД амплифицировали с помощью Pfu полимеразы в ПЦР со следующими праймерами верхней и нижней полоски: 5’GATCCTCATAAAGGCCATGGGCT GGAGCTGCCTTGTT3’ и 5’CCGCTCGAGTTAACCCACATGCACATCTC TGTC 3’, соответственно. Затем кДНК клонировали с ТОРО-ТА клонирующим вектором и обрабатывали EcoN1 и XhoI. Это вводило рамку считывания 3-бетаГСД в ген люциферазы в кодон 541, приводя к потере 9 терминальных кодонов люциферазы. Продукт pGEM-luc-3бета-HSD, его достоверность подтверждалась с помощью автоматического сиквенса.

Кроме введения целой молекулы 3бетаГСД в pGEM-luc, были созданы и клонированы в те же участки три фрагмента фермента, перекрывающиеся на 50 пар оснований: pGEM-luc-3бетаHSD1-450 (число отражает пары оснований, соответствует 1-150 аминокислотам 3бетаГСД), pGEM-luc-3бетаHSD399-849 (аминокислоты 133-283 3-бетаГСД) и pGEM-luc-3бетаHSD798-1116 (аминокислоты 266-372). Фрагменты получали с помощью ПЦР-амплификации с Pfu полимеразой оригинальной кДНК3-бетаГСД, используя следующие пары праймеров: 5’GATCCTCATAAAGGCATGGGCTGGAGCTHCCTTGT 3’ и 5’CC GCTCGAGTTAGTTTTCCAGAGGCTCTTCTTC3’; 5’GATCCTCATAAAGGCCTCCTACAAGGAAATCATCCA 3’ и 5’CCGCTCGAGTTAGGAATC AAGGCGGAGGCCG 3’; 5’GATCCTCATAAAGGCCAACCTTAATTACACCC TGAGC 3’ и 5’CCGCTCGAGTTAACCCACATGCACATCTCTCTGTC 3’. Все три фрагмента подтверждены с помощью автоматического сиквенса.

Все продукты были транслированы и помечены радиоактивной меткой с помощью системы транскрипции/трансляции на кроличьих ретикулоцитах. Трансляцию проводили соответственно инструкции производителя, метили протеины либо 35S-метионином, либо L-[4,5-3H]-лейцином в случае кДНК 3-бетаГСД, клонированной в pSP64, либо только 35S-метионином для продуктов pGEM-luc. Вектор pGEM-luc также транслировали и получали контрольный протеин, меченный 35S-метионином. Продукты трансляции изучали с помощью SDS-PAGE и ауторадиографии.

Для каждого образца 17000-20000 cpm трансляционной смеси разводили до конечного объема 20 мкл в буфере для иммунопреципитации (10 ммоль HEPES (рН7,4), 0,5 ммоль метионина, 150 ммоль хлорида натрия, 10 ммоль бензамидина, 0.01% BSA, 0,5% Triton-X-114) и инкубировали с сывороткой до конечного разведения 1:5 в течение ночи при температуре 4С. 10 мкл Protein-A Sepharose (суспензия отмывалась дважды в буфере для иммунопреципитации и повторно разводилась в 0,5 мл буфера для преципитации на 1 мл Protein-A Sepharose) добавляли к каждому образцу и инкубировали при 4С в течение часа, встряхивая. Иммунные комплексы отмывали 5 раз в 0,5 мл буфера для иммунопреципитации, последнее отмывание производили в 0,5 мл стерильной воды, и анализировали с помощью SDS-PAGE и фосфовизуализатора. В каждый анализ добавляли контрольную кроличью антисыворотку к люциферазе и 3-бетаГСД. Также в каждый анализ добавляли сыворотку, позитивную по СПК-АТ и негативную контрольную сыворотку. Количественный подсчет продукта иммунопреципитации с помощью фосфовизуализатора Продукты преципитации разделяли в 10% SDS-PAGE, затем гель экспонировали в течение как минимум 48 часов, получали изображение, сканировали его и с помощью компьютерной программы измеряли интенсивность связывания.

Выход меченого 3бетаГСД

Выход протеина, меченного 35S, из системы транскрипции/трансляции с pSP64 был очень мал, давая недостаточное количество для иммунопреципитационного анализа. В целом мечение считается достаточным для иммунопреципитации, если число меток как минимум в 5-10 раз выше, чем в негативной контрольной реакции. Мечение протеина с помощью L-[4,5-3H]-лейцина так же было недостаточным.

Для решения проблемы малого выхода 3бетаГСД клонировали с люциферазой, белком, мечение которого в этой системе доказанно достаточное. Продукт 3-бетаГСД-люцифераза имел ожидаемый размер 103 кДа на SDS-PAGE и преципитировался как 3-бетаГСД, так и люцифераза-специфическими антисыворотками, что показывает, что антигенные эпитопы обоих протеинов доступны для антител.

Транслированная и меченная радиоактивным изотопом смесь люцифераза-3бетаГСД использовались для определения аутоантител методом иммунопреципитации. Радиоактивность, связанная с иммунопреципитацией, определяемая по сцинтилляции жидкости, недостаточно чувствительна для различения позитивной и негативной сыворотки. По этой причине использовали более чувствительный подход, при котором продукты преципитации разводили в 10% SDS-PAGE, сравнивали с помощью компьютерной пограммы и оценивали количественно в сравнении с негативной контрольной сывороткой.

У 12 пациенток (12%) с идиопатической преждевременной яичниковой недостаточностью были положительны аутоантитела к 3бетаГСД в этом анализе.

Ни одна из 103 контрольных сывороток не проявила какой-либо реактивности (рис.2), разница в частоте встречаемости аутоантител между пациентками и контрольной группой была достоверной (р меньше 0,0001). Для убеждения в том, что реактивность была связана именно с 3бетаГСД, а не с люциферазной частью, все положительные образцы были протестированы с помощью иммунопреципитации на реактивность с люциферазой изолированно, и все тесты были негативными.

Ранее, используя метод иммуноблот, мы отметили присутствие аутоантител к 3бетаГСД у 25 из 118 (21%) пациенток с идиопатической преждевременной яичниковой недостаточностью и у 5% здоровых лиц контрольной группы. Из этих 25 пациенток у 20 сыворотка была доступна для проведения метода иммунопреципитации. 14 из 20 сывороток, положительных при иммуноблоте, были негативны при иммунопреципитации, остальные же 6 сывороток были позитивны при обоих методах.

Система HLA представляет собой группу высоко полиморфичных генов на 6 хромосоме, вовлеченных в иммунную функцию. Ассоциации между аутоиммунными расстройствами, позитивностью по аутоантителам и подтипами HLA (например, ассоциация между HLA-DQ8, СД1, аутоантителами к декарбоксилазе глютаминовой кислоты) используются для подтверждения аутоиммунной природы заболевания. В наших предыдущих исследованиях генотип HLA-DQВ, кодирующий аспартат в позиции 57, был связан с преждевременной яичниковой недостаточностью. В связи с этим мы обследовали частоту встречаемости этого генотипа в связи с аутоантителами, определяемыми новым методом.

Частота встречаемости HLA-DQбета-Asp57 была проанализирована у 12 пациенток, позитивных по аутоантителам к 3бетаГСД, определяемым методом иммунопреципитации. В этой когорте данные HLA были доступны у 11 из 12 пациенток, 10 из этих 11 (91%) были позитивны по генотипу HLA-DQбета-Asp57, более того, 2 из 10 (20%) были по нему гомозиготны. Ранее, при использовании метода иммуноблот, 18 из 21 (85%) пациенток оказывались позитивны по генотипу HLA-DQбета-Asp57. В контрольной популяции 92 пациентки из 134 (68%) были позитивны по генотипу HLA-DQбета-Asp57, из них 13% гомозиготны. При анализе методом “хи-квадрат” частота встречаемости генотипа HLA-DQбета-Asp57 достоверно не различалась между пациентками и контрольной группой.

У 11 из 12 пациенток с аутоантителами к 3бетаГСД была вторичная аменорея, у 1 – первичная. Данные по тиреоидным и надпочечниковым аутоантителам были доступны у 11 из этих 12 пациенток. У 4 пациенток были тиреоидные аутоантитела ( у 1 к микросомам, у 1 к тиреоглобулину, у 2 оба вида антител), у 1 из них были клинические признаки гипотиреоза.

Тот же метод, что описан выше, использовался для определения аутоантител к каждому из трех фрагментов 3-бетаГСД, связанного с люциферазой. Сыворотка была доступна у 9 из 12 пациенток, позитивных по аутоантителам к 3бетаГСД.

Ни одна из сывороток не проявила какой-либо реактивности с фрагментом 2 (pGEM-luc-3бета-HSD399-849). 2 сыворотки (22%) проявили реактивность к фрагменту 1 (pGEM-luc-3бета-НSD1-450). 7 сывороток (77%) реагировали с фрагментом 3 (pGEM-luc-3бета-HSD798-1116). Из 5 пациенток, позитивных по аутоантителам к 3бетаГСД по результатам обоих методов, сыворотка одной показала реактивность с фрагментом 1 (N-концевым), 3 – с фрагментом 3 (С-концевым). Сыворотка одной пациентки реагировала с обоими фрагментами – 1 и 3.

Целью настоящего исследования было определить аутоантитела к 3бетаГСД в сыворотке пациенток с преждевременной яичниковой недостаточностью, используя количественный и чувствительный метод радиоиммунопреципитации. Дополнительной целью было определить, не сфокусирована ли реактивность избирательно на отдельных частях молекулы. Вначале мы попытались пометить протеин 3бетаГСД, используя 35S-метионин, L-[4,5-3H]-лейцин и широко используемую для транскрипции/трансляции in vitro плазмиду pSP64. Однако ни один из этих методов не привел к получению достаточного количества меченного протеина. По этой причине кДНК 3бетаГСД связали с люциферазой, что привело к образованию большого количества меченного протеина, распознающегося обоими антисыворотками – и к 3бетаГСД и к люциферазе. Люцифераза была выбрана для связывания, поскольку она очень эффективно транслируется и связывается с метками в системе транскрипции/трансляции in vitro. Это не первое исследование, где она так используется. Например, при болезни Грейвса, при которой антитела к рецептору ТТГ обычно присутствуют в низком уровне и с трудом определяются обычными методами, использование рецептора к ТТГ, связанного с люциферазой, в реакции иммунопреципитации дает положительные результаты, хорошо коррелирующие с уровнем связывания аутоантител, определяемым биохимическим анализом. Мечение 3бетаГСД с помощью 35S-цистеина не подходит для настоящего исследования, так как одной из его целей является идентификация эпитопа 3бетаГСД, предпочтительно связывающего сыворотку пациентов. Отсутствие остатков цистеина в С-концевом участке (аминокислоты 260-372) не позволяют нам использовать радиоактивный цистеин. И наоборот, используя связь с хорошо поддающимся меткам протеином (люциферазой) позволило нам определить аутоантитела к любому участку 3бетаГСД, независимо от его аминокислотного состава.

Метод иммунопреципитации связанного протеина 3бетаГСД-люциферазы привел к определению аутоантител к 3 бета-ГСД у 12% пациенток с идиопатической преждевременной яичниковой недостаточность и ни у одной из обследованных нами здоровых женщин. Эти результаты позволяют предположить, что метод иммунопреципитации имеет большую специфичность, чем метод иммуноблот, который мы использовали ранее, при котором были позитивны 5% контрольных сывороток. Сравнительные результаты исследования сывороток обоими методами выявляют низкую конкордантность между ними, что отмечают и другие исследователи. Самое доступное объяснение низкой конкордантности между методами иммунопреципитации и иммуноблота – это природа антигена в этих исследованиях. В иммуноблоте 3бета-ГСД денатурирован кипячением, выдержан с химическими денатураторами и связан с нитроцеллюлозой. Это разрушает втоичную и третичную структуру белка, оставляя линейную молекулу. Связывание аутоантител с линейной молекулой зависит от их способности связываться с определенной аминокислотной последовательностью (линейные эпитопы). При иммунопреципитации антиген имеет нативную конформацию, сохраняя свою вторичную и третичную структуры. Многие типы аутоантител способны связываться именно с конформационными структурами (конформационные эпитопы) и не связывают линейные антигены. Наши результаты позволяют предположить, что в случае определения аутоантител к 3бетаГСД, антитела, связывающие линейные эпитопы, и выявляемые методом иммуноблот, менее специфичны, чем те, что связывают конформационные эпитопы и определяются методом иммунопреципитации.

Предыдущие исследования показало более редкую встречаемость аутоантител к 3бетаГСД у пациенток с преждевременной яичниковой недостаточностью, чем мы определили сейчас. Этот разброс скорее всего является результатом методологических различий. В частности, система для определения связывания в нашем исследовании, была – фосфовизуализатор, что более чувствительно, чем ауторадиография, использованная Reimand et al. Кроме того, имеются различия в характеристиках пациентов в разных исследованиях. В частности, в нашем исследовании пациентки были более молодыми. Интересно, что Reimand et al отмечали присутствие аутоантител к 3 бетаГСД у 20% пациентов с аутоиммунным полиэндокринным синдромом 1, но неизвестно, была ли у кого-то из этих пациентов яичниковая недостаточность.

У пациенток с аутоантителами к 3бетаГСД в настоящем исследовании наблюдалась сильная взаимосвязь с генотипом HLA-DQбета-Asp57 – 90% по сравнению с 68% в контрольной популяции. Хотя эта разница статистически не достоверна, возможно причиной является недостаточная количественная выборка. Такие взаимосвязи между наличием аутоантител и определенным типом HLA-DQ наблюдается при других аутоиммунных расстройствах, таких как СД1, при которых аутоантитела к декарбоксилазе глютаминовой кислоты ассоциированы с генотипами DQ2/8 или DQ2/X. Взятые вместе, эти находки поддерживают вывод о том, что приблизительно 12% пациенток с идиопатической преждевременной яичниковой недостаточностью имеют аутоиммунный патогенез своего заболевания. Однако в настоящее время не ясна роль аутоиммунитета к 3-бетаГСД в патогенезе заболевания. Дальнейшие исследования сконцентрированы на характеристиках аутоантител к этому фермент, но вряд ли аутоантитела сами собой вызывают повреждение ткани, поскольку 3бетаГСД также присутствует в тканях (например, кора надпочечников), не повреждающихся у пациенток с преждевременной яичниковой недостаточностью. В настоящем исследовании мы использовали кДНК 3бетаГСД II типа как источник антигена, который в основном экспрессируется в надпочечниковой и яичниковой ткани. Возможно, что аутоантитела, которые мы определили, также перекрестно реагировали с вненадпочечниковым, I типом фермента, поскольку типы обладают 93% гомологией. Исходя из знаний о других аутоиммунных органоспецифических расстройствах, сопровождающихся аутоантителами к ферментам, дисфункция ферментативных процессов наблюдается редко. Согласно результатам настоящего исследования, основной эпитоп для аутоантител к 3бетаГСД лежит в области аминокислотных последовательностей 1-150 и 266-372, участок 133-283 не обладает реактивностью. Все пациентки, положительные по аутоаттителам к 3-бетаГСД, демонстрируют реактивность по крайней мере к С– или N-концевой части. Возможно, что существуют другие эпитопы, но они непрерывны и требуют интактности молекулы. Другие исследователи отмечают, что иммунодоминантный регион молекулы 3бетаГСД находится в N-концевом участке, и настоящее исследование подтверждает этот вывод. Хотя каждый из фрагментов 3-бетаГСД преципитировал со специфичной к 3-бетаГСД антисывороткой, мы не можем исключить возможности того, что связь с люциферазой нарушает связывание с антителами и это приводит к сниженной реактивности N-концевого участка молекулы и к потере реактивности региона 133-283.

Аутоантитела к 3бетаГСД могут определяться в сыворотке пациенток с преждевременной яичниковой недостаточностью методом иммунопреципитации протеина, связанного с люциферазой, и реактивность выявляется напрямую против N– и С-концевого участков молекулы. Аутоантитела к 3-бетаГСД ассоциированы с определенным генотипом HLA-DQ. Это исследование демонстрирует необходимость более точных методом исследования для обспечения конкордантности между различными исследованиями, чтобы повысить диагностическую и прогностическую ценности определения аутоантител к 3бетаГСД.

Генотип HLA DQB1, кодирующий аспартат в позиции 57, связан с аутоиммунитетом к 3-бета-гидроксистероиддегидрогеназе при преждевременной яичниковой недостаточности

S.Arif, J.A.Underhill, P.Donaldson et al

J.Clin. Endocrinology and Metabolism, 1999,Vol 84, No3, pp 1056-1060

Преждевременная яичниковая недостаточность – это потеря функции яичников до 40 лет, является важной причиной первичного и вторичного бесплодия. У многих женщин механизм преждевременной яичниковой недостаточности не объяснен, около 20% случаев идиопатической преждевременной яичниковой недостаточности приписывают аутоиммунный механизм развития. В пользу этой гипотезы служит наличие аутоантиетл против антигенов яичников, лимфоцитарная инфильтрация по результатам биопсии яичников и связь между развитием преждевременной яичниковой недостаточности и других аутоиммунных расстройств.

Одним из классов аутоантител, описанных при преждевременной яичниковой недостаточности, являются аутоантитела к стероидным клеткам, взаимодействующие с корой надпочечников, яичниками и тестикулами. Мы идентифицировали основную мишень АСК – фермент стероидных клеток 3-бета-гидроксистероиддегидрогеназа (3-бетаГСД), аутоантитела к этому ферменту обнаружены у 21% пациенток с идиопатической преждевременной яичниковой недостатоностью. Мы предположили, что аутоантитела к 3-бета-ГСД могут быть маркером истинной аутоиммунной преждевременной яичниковой недостаточности и использоваться для подбора иммунной терапии пациенткам, предположительно наиболее к ней чувствительным. В настоящем исследовании мы искали дальнейших подтверждений тому, что наличие аутоантител к 3-бетаГСД определяют подгруппу преждевременной яичниковой недостаточности с аутоиммунным патогенезом. Многие известные органоспецифические аутоиммунные нарушения связаны с шенами HLA 2класса. Продукты генов HLA 2 класса (участка хромосомы 6р21.3), включая те, что кодируют молекулы HLA-DR, -DQ, -DP. Эти гликопротеиды клеточной поверхности представляют собой пептидные антигены CD4+Т-хелперов и играют ключевую роль в иммунном ответе. Гены HLA –DR, -DQ, -DP обладают высокой степенью полиморфизма. Имеют множество различных аллельных форм, формируя молекулы с разными пептидо-связывающими свойствами. Мы определяли генотипы HLA DRB1, DQB1 в когорте пациенток с идиопатической преждевременной яичниковой недостаточностью, включая подгруппу пациенток с антителами к 3-бетаГСД как маркером аутоиммунной патологии.

В исследование были включены 118 женщин с идиопатической преждевременной яичниковой недостаточностью (средний возраст наступления 26 лет, 11-39 лет). Преждевременную яичниковую недостаточность определяли как гипергонадотропную аменорею с сывороточными уровнями ЛГ и ФСГ более 10 МЕ/л, измеренные дважды, и отсутствие менструаций в течение как минимум. Пациентки с синдромом Тернера, кастрационным синдромом, галактоземией и дисгенезией гонад 46, ХУ были исключены из исследования.

У 17 пациенток аменорея была первичная, у 101– вторичная. Болезни Аддисона не было ни у кого. У 4 пациенток была аутоиммунная патология щитовидной железы, из нх у 3 – гипотиреоз, корригируемый Л-тироксином, а у 1 – болезнь Грейвса.

Аутоантитела к 3-бетаГСД измеряли методом вестернблот. Антитела к стероидпродуцирующим клеткам определяли с помонью непрямой иммунофлюоресценции на срезах надпочечников, тестикул и яичников обезьян. Аутоантитела к тиреоглобулину и тиреоидной пероксидазе определяли с помощью агглютинации в геле.

Аллели 32 антигенов HLA класса 2 DRB1, DQB1 определяли с помощью ПЦР-амплификации. Контрольную группу составили 134 женщины из тех же географических областей, что пациентки с преждевременной яичниковой недостаточностью. В отсутствии генеалогических сведений невозможно было определить истинные гаплотипы, т.о определяли только избранные.

Из 118 пациенток с преждевременной яичниковой недостаточностью, участвовавших в исследовании, ДНК образцы были доступны у всех, образцы сыворотки – у 97 пациенток. В начале мы сравнивали частоту генотипов HLA DR и DQ у пациенток с преждевременной яичниковой недостаточностью и контрольной группы. Единственным достоверным различием было повышение частоты встречаемости генотипа DRB1*1101/3 у пациенток с преждевременной яичниковой недостаточностью (хи квадрат=8,0, р меньше 0,0047). Повышение частоты встречаемости DQB1*0603 и 0301 также отмечалось (хи квадрат =4,2 и 5,03, соответственно, р = 0,041 и 0.025, соответственно), а также снижение частоты встречаемости генотипа DQB1*0302. Когда пациенток разделили на группы с и без антител к 3-бетаГСД (Табл. 1 и 2), наметились явные тенденции. У 21 из 97 (21,6%) пациенток были аутоантитела к 3-бетаГСД. У пациенток с преждевременной яичниковой недостаточностью и антителами к 3-бетаГСД была повышена частота встречаемости аллелей DQB1*0603 (25%) и 0301 (42,9%) по сравнению с контрольной группой (6,0% и 33,6%, соотвенственно; хи-квадрат=7,5 и 4,3; р=0,006 и 0,037, соответственно. Повышение частоты встречаемости генотипа DQB1*0301 сочеталось со значительно более высокой частотой гаплотипа DRB1*04/DQB1*0301, который был представлен у 9 пациенток (21,4% из возможных гаплотипов) с аутоантителами к 3-бетаГСД и только у 20 женщин контрольной грппы (7,5%, хи-квадрат=8,35, р=0,0039).

Повышение частоты встречаемости генотипов DQB1*0603 и 0301 у пациенток с ауотанителами к 3-бетаГСД, а также снижение частоты встречаемости DQB1*0302 особенно интересно при анализе аминокислотной последовательности DQ-бета цепей. Помимо участков полиморфизма в локусе DQB1 GQB1*0603 и –0301 кодируют идентичные аминокислотные остатки в позициях 14, 38, 57, 71, 74-75, 77 и 116. Единственное положение, отличающееся от DQB1*0302 – это позиция 57. В аллелях 063 и 0301 эта позиция занята аспартатом, а в аллеле 0302 – аланином. Имея это в виду, мы определяли частоту DQ-бета-Asp57-кодирующих генов, а именно: DQB1*0301, 0303, 0402, 0503, 0601-3 (DQB1*0203, 0401, 0306, 0607, 0611, 0614) – табл. 3 Частота DQбета-Asp57-кодирующих генов у пациенток с аутоантителами к 3-бета-ГСД составила 7 из 42 гаплотипов по сравнению со 109 из 268 в контрольной группе (хи квадрат=8,2, р = 0,004) и 9 из 21 (48%) пациенток были гомозиготными по сравнению с 17 из 134 (12,7%) в контрольной группе (хи квадрат=11,8, р=0,0006).

Напротив, распределение гаплотипов DRB1 и DQB1 у пациенток с преждевременной яичниковой недостаточностью, негативных по аутоантителам 3-бетаГСД, совпадало с таковым в контрольной группе, с 1 исключением. В негативной по аутоантителам группе была аномально повышена частота гаплотипа DR11-DQB1*0301 – у 76 (21%) по сравнению с 16 из 134 (11,9%) контрольной группы (хи-квадрат=9,5, р= 0,002).

Аутоантитела к стероидпродуцирующим клеткам обнаружились у 4 пациенток – к 3-бетаГСД (в зонах клубочковoй и пучковой) – но не к 21-альфа-гидроксилазе (во всех трех зонах). Антитела к яичниковой ткани присутствовали у 1 пациентки. Частота аутоантител к тироидным микросомам и тиреоглобулину соответствовала описанной ранее. Ни у одной пациентки контрольной группе таких антител не было.

Принятие этих аутоантител как маркеров аутоиммунитета у пациенток с преждевременной яичниковой недостаточностью не повысило значимость какой-либо ассоциации HLA.

В настоящем исследовании мы изучали распределение генотипов HLA-DRB1 и DQB1 у пациенток с идиопатической преждевременной яичниковой недостаточностью, у которых мы также определяли аутоантитела к ферменту стероидпродуцирующих клеток – 3-бетаГСД. Целью исследования было оценить взаимосвязь между аутоиммунитетом к 3-бетаГСД и определенными генотипами HLA-DRB1 и HLA-DQB1, чтоб пролить свет на возможную роль этого фермента в патогенезе яичниковой недостаточности. Наши результаты показали, что генотипы DQB1*0301 и –0603 чаще обнаруживаются у пациенток с преждевременной яичниковой недостаточностью и аутоантителами к 3-бетаГСД. Мы показали, что у пациенток с преждевременной яичниковой недостаточностью, имеющих аутоантитела к 3-бетаГСД, чаще имеются гены DQбета-цепи, кодирующие аспартат в 57 позиции, и чаще, чем у женщин контрольной группы, определяется гомозиготность по этим генам. Молекулы HLA 2 класса, DR и DQ являются гетеродимерами, каждый из которых состоит из альфа– и бета-цепей, приблизительно 29-34 кДа. Гетеродимеры формируют комплексы с короткими пептидами (13-24 аминокислоты), образующихся в результате ферментативного процессинга экзогенных или аутоантигенов. Пептиды связываются со специальными связывающими участками, затем комплекс молекула/пептид экспрессируется на поверхности антиген-презентирующей клетки для презентации антиген-специфическим рецепторам на CD4+ Т-хелперах. Между людьми антигены HLA 2 класса обладают выраженным полиморфизмом, что приводит к вариабельности специфических аминокислотнх остатков в антиген-связывающих участков. Это оказывает влияние на степень связывания пептидов, которое, в свою очередь, влияет на созревание и периферическую активацию Т-клеток, хотя пока еще точно не известно, как эти события способствуют развитию аутоиммунной патологии.

Многие известные аутоиммунные расстройства связаны с генотипом HLA – генами HLA-DRB1 и HLA-DQB1: инсулинзависимый сахарный диабет (DQB1*0302), целиакия (DQB1*0201), буллезный пемфигоид (DQB1*0301), аутоиммунный гепатит (DRB1 гены, кодирующие лизин в позиции 71 DR-бета-цепи). 57 позиция HLA-DR занимает ключевое положение в связывающем участке. Аспартат в позиции 57 способствует формированию мостика с аргинином в позиции 76 альфа-цепи, а в отстутствии аспартата в этом положении такая конформация невозможна. Это единственное аминокислотное различие оказывает значительное влияние на степень связывания пептидов, а следовательно – на иммунный ответ.

Предыдущие исследования также пытались определить HLA-ассоциации с преждевременной яичниковой недостаточностью. Наше исследование на небольшой группе пациенток (19 человек) отметило взаимосвязь между HLA-DR3, обнаруженным у 48% пациенток (по сравнению с 23% в контроле), другие исследователи обнаружили слабую связь с HLA-DR4, а еще одни – отсутствие всякой взаимосвязи. Каждое исследование базировалось на серологическом определении HLA-DR, и ни одно не включало подгруппу пациенток с аутоантителами. Серологическое исследование дает менее достоверные результаты, чем ДНК-техника, использовавшаяся в настоящем исследовании, и не позволяет различить основные аллели HLA-DQB1.

Интересно, что высокая частота встречаемости генов HLA-DRB1*1101/3, которую мы зафиксировали у наших пациенток, была именно у тех пациенток, у которых отсутствовали аутоантитела к 3-бетаГСД. Мы рискуем предположить, что пациенты с генотипом DRB1*11 могут образовывать другую подруппу пациенток с аутоиммунной преждевременной яичниковой недостаточностью, у которых мишень воздействия аутоантител не является 3-бета-ГСД

См. также другие переводы, книги, научные статьи, обзоры, диссертации и полезные ссылки в разделе "Врачам"